1.1    獲得不能培養的生物的多樣性：生物群落DNA概念
    過去的十年見證了一些新的、不依賴于培養的、基于分子生物學的方法的開發，比如熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和16S rDNA克隆文庫。這些方法引發了一系列的生態學研究，徹底改變了人們對微生物多樣性的看法。這些技術包含在某一時刻用探針（FISH）或者提取一個生活環境（habitat）中所有微生物的基因組（DNA材料）來直接檢測樣品中的微生物。而這個提取到所有微生物的基因組就是生物群落DNA（the community DNA）或“宏基因組（metagenome）”。
    在隨后的基于聚合酶鏈反應（PCR）的研究中，以宏基因組為模板，一個特異的基因或者DNA序列被數百萬次地擴增，這表明不能培養的微生物中存在著巨大的多樣性。在此類研究中，通過PCR擴增感興趣的基因或者DNA片斷后，接著就是克隆和確定它的序列。簡而言之，克隆就是將外源DNA序列通過DNA重組技術插入到一個含有遺傳標記（比如抗生素抗性基因）的載體（通常是一個質粒）中，這個遺傳標記的作用是選擇出那些插入了外源DNA的載體。然后將這個載體導入一個宿主細胞中，接著在培養基中繁殖細胞，并涂布到選擇性培養基中（含有用于選擇標記的抗生素的富培養基）。這樣外源DNA就能隨著細胞的復制被數百萬次的復制。
    Pace及其同事最早提出了克隆核糖體基因（ribosomal gene，rDNA）來從環境樣品中尋找不能培養的微生物，并通過比較所獲得的rDNA序列和公開的數據庫中已知生物體的序列數據，繪制它們在種族史上的關系圖。隨后這一方法被作為分析許多不同環境的多樣性的一種標準方法，顯示了從未由培養獲得的、令人驚訝的新微生物種類的多樣性。
    作為一個分子生態學的研究進展，已經有證據表明許多新的血統都是在地理學上廣泛分布的，并常常顯示了微生物種類的豐富組成。盡管如此，由于對大多數已經發現的種類來說，分離和培養仍然比較困難，因此對于這些在環境中檢測到的新的微生物種類的代謝潛力，分子微生物生態學研究給予我們的信息仍然很有限。
1.2    拆分代謝功能 ：BAC策略
    開發那些不能通過傳統的培養技術培養的微生物（無法培養的微生物）的代謝潛力的另一種方法是一種分子策略，包括使用細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC ）來克隆非常大的DNA片段（20kb到500kb），它可以攜帶環境樣品中整個基因簇（gene cluster）或者甚至是一個完整的生物化學途徑。在尋找新的酶活時，該策略包括克隆這些來源于環境生物群落DNA（宏基因組）的大的DNA片斷，以及分析所得到的復雜的宏基因組文庫。
    BAC是來源于大腸桿菌F的質粒的特殊克隆體系。該質粒在一個細胞中只復制1～2個拷貝數。BAC同樣具有大多數克隆載體都具有的典型特征，包括一個多克隆位點和一個快速的克隆選擇機制（clone seledtion mechanism）。BAC最早起源于繪制染色體圖譜（chromosome mapping）和分析人類基因組。它能攜帶超過300kb的DNA插入，能夠在異源的細菌宿主中表達原核基因。這個異源的細菌宿主也就是指一個與基因最初的克隆來源不同種類的細菌菌株，它們可能含有不同的基因表達和調控體系。這些載體能夠在大腸桿菌中穩定地保持大片斷的DNA插入，也是目前細菌和真菌基因組計劃中最常用的載體。此外，對于某些特定的原核生物，比如許多原始生物（Archaea)，由于它們在高拷貝數的質粒中不穩定，以前人們根本無法克隆其基因組，然而現在，BAC克隆使得研究它們的基因組成為可能。

    BAC在宿主細胞中的底拷貝數可以避免所克隆的插入之間發生基因重組。但是，BAC對功能篩選研究的一個重要缺陷就是，對于載體自身及攜帶了基因組插入的載體，DNA的收率太低。Wild等描述了一種新的BAC載體，它不僅保留了低拷貝數的BAC載體的所有優勢，還具有一個可調控的、控制嚴謹的增擴體系。該體系基于oriV復制起始，因而依賴于TrfA復制蛋白。該載體系統可以在L-阿拉伯糖（L-arabinose）的條件誘導下達到每個宿主細胞約100個載體的拷貝數?？蓴U增的克隆和文庫，因其基因的高水平表達，非常有利于高通量的DNA測序和基于酶活的篩選。該系統也可以進一步被葡萄糖和海藻糖（拷貝數的抑制劑）調控，這提高了宿主細胞中BAC的穩定性，使得系統非常強大和可靠。
    人們已經從海洋環境中用BAC載體建立起包含大的DNA插入（高達40kb,有時甚至超過100kb）的復雜的基因組文庫，這為洞察那些不能培養的浮游海洋古生物的基因組潛力提供了可能。這一環境克隆方法也已經成功用于研究土壤中的微生物群落。盡管如此，由于宏基因組方法的成功完全取決于提取的DNA純度和可克隆性，而土壤樣品中存在的諸如腐殖酸（humic acid）和棕黃酸（fulvic acid）等高分子里量的抑制劑使土壤樣品比含水樣品更難于制備宏基因組文庫。目前已經提出了許多從土壤中提取DNA的操作步驟，基本上可以將它們分為以下兩類。
    在第一類方法，也稱為直接法中，微生物在土壤基質中被裂解。直接用裂解緩沖液重懸土壤，接著用洗滌劑和酶充分處理。這類方法中大多數都包括劇烈地機械攪動和使用玻璃珠破碎微生物細胞（玻璃珠敲打）。得到的DNA接著再用酚/氯仿進行萃取，并在瓊脂糖凝膠上區分大小。這種方法的優點是DNA收率高，并且由于破碎細胞壁的成功率較高，樣品中不同種類的微生物的DNA分布相對比較好。盡管如此，由于機械剪切力的不同，得到的DNA片斷的大小范圍一般是從1kb到50kb。
    在第二類方法，也稱為間接法中，需要在裂解前用物理方法從土壤顆粒和膠體中分離出微生物。這減少了有機和無機的土壤化合物對DNA提取和純化步驟的抑制作用，也可以極大地減少釋放出來的基因組DNA所受的機械應力（mechanical stress）。在許多開發土壤宏基因組以尋求具有生物活性的新產物的研究中，這種方法是首選。將土壤中的細菌細胞通過攪拌機進行分離，隨后在一個梯度發生基質（gradient-making matrix）中進行離心回收。然后用瓊脂糖封閉土壤生物質，并在固化性的細胞上進行裂解。之后，用限制性核酸內切酶部分消化基因組DNA，再在脈沖電場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）中區分片斷大小。通過電洗脫（electrolution）將那些高分子量的DNA片斷從瓊脂糖中回收出來，再連接到BAC載體中得到宏基因組文庫。間接法的一個優點是在DNA制備中減少了大量非微生物的土壤成分的污染。然而它的缺點卻是：從土壤基質中制備細菌組分時會損失一部分微生物，結果導致DNA收率低。除此之外，由于該方法的機械應力較小，一些具有較厚細胞壁的微生物種類，比如說革蘭陽性細菌，可能沒有被裂解，因此最后得到的宏基因組DNA中也缺少它們。
    當使用BAC策略克隆細菌基因組時，由于外源基因也是來源于原核生物的，因此在BAC克隆中很容易獲得基因表達。在含有BAC系統的大腸桿菌中，可以在一個合理的頻率內檢測到一個來自于蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）的異源DNA的表達，這說明低拷貝數的BAC載體也可以用于在大腸桿菌中表達外源DNA。
    正如前面指出的那樣，BAC文庫為獲得環境中的微生物多樣性提供了一種具有前景的、強有力的方法，使得人們能夠分析不同微生物，尤其是那些不能培養的微生物的功能基因。在這個意義上，與傳統的尋求新的天然產物的方法（基于提取、培養和篩選純的微生物培養物）相比，從一個宏基因組的BAC文庫中可以同時獲得范圍更廣的具有生物活性的化合物。